Ани Михайлова е родена на 8 декември във Варна в семейство на икономисти. Завършва гимназия с разширено изучаване на английски език. През 1992 г. завършва специалност актьорско майсторство за драматичен театър във ВИТИЗ в класа на Стефан Данаилов. След това постъпва на щат в Държавния пътуващ театър. Изиграва много комедийни роли и участва в чуждестранни продукции: френско-италианската „Варсенжеторикс“, в „До смърт“ с Жан Колд ван Дам, в „Децата на Нонантола“. Дебютното шоу в което участва е „Коктейлите на Влади“ по Ефир 2. След това две години участва в „Мамалев шоу“ по Военния канал. От 16 юли 2007 г. Ани Михайлова става част от екипа на „Шоуто на Канала“ по БНТ 1. През 2006 г. завършва магистратура по Приложна психология във Варненския свободен университет.